Alignement de séquences multiples

L'alignement de séquences multiples ( MSA ) est le processus ou le résultat de l'alignement de séquences de trois ou plusieurs séquences biologiques , généralement des protéines , de l'ADN ou de l'ARN . Ces alignements sont utilisés pour déduire des relations évolutives via une analyse phylogénétique et peuvent mettre en évidence des caractéristiques homologues entre les séquences. Les alignements mettent en évidence des événements de mutation tels que des mutations ponctuelles ( changements d'acide aminé ou de nucléotide unique ), des mutations d'insertion et des mutations de délétion , et les alignements sont utilisés pour évaluer la conservation des séquences et déduire la présence et l'activité de domaines protéiques , de structures tertiaires , de structures secondaires et d'acides aminés ou de nucléotides individuels.

Les alignements de séquences multiples nécessitent des méthodologies plus sophistiquées que les alignements par paires , car ils sont plus complexes en termes de calcul . La plupart des programmes d'alignement de séquences multiples utilisent des méthodes heuristiques plutôt qu'une optimisation globale , car l'identification de l'alignement optimal entre plusieurs séquences de longueur moyenne est extrêmement coûteuse en termes de calcul. Cependant, les méthodes heuristiques ne peuvent généralement pas garantir des solutions de haute qualité et il a été démontré qu'elles ne parviennent pas à produire des solutions quasi optimales sur des cas de test de référence.

Étant donné des séquences , similaires à la forme ci-dessous :

Un alignement de séquences multiples est réalisé à partir de cet ensemble de séquences en insérant la quantité d'espaces nécessaire dans chacune des séquences de jusqu'à ce que les séquences modifiées, , soient toutes conformes à la longueur et qu'aucune valeur dans les séquences de de la même colonne ne soit constituée uniquement d'espaces. La forme mathématique d'un MSA de l'ensemble de séquences ci-dessus est présentée ci-dessous :

Pour revenir de chaque séquence particulière à , supprimez tous les espaces.

Une approche générale lors du calcul de plusieurs alignements de séquences consiste à utiliser des graphiques pour identifier tous les différents alignements. Lors de la recherche d'alignements via un graphique, un alignement complet est créé dans un graphique pondéré qui contient un ensemble de sommets et un ensemble d'arêtes. Chacune des arêtes du graphique a un poids basé sur une certaine heuristique qui permet de noter chaque alignement ou sous-ensemble du graphique d'origine.

Lors de la détermination des alignements les mieux adaptés à chaque MSA, une trace est généralement générée. Une trace est un ensemble de sommets réalisés , ou correspondants et alignés, qui a un poids spécifique basé sur les arêtes sélectionnées entre les sommets correspondants. Lors du choix des traces pour un ensemble de séquences, il est nécessaire de choisir une trace avec un poids maximal pour obtenir le meilleur alignement des séquences.

Il existe différentes méthodes d'alignement utilisées dans plusieurs séquences pour maximiser les scores et l'exactitude des alignements. Chacune d'entre elles est généralement basée sur une certaine heuristique avec un aperçu du processus évolutif. La plupart tentent de reproduire l'évolution pour obtenir l'alignement le plus réaliste possible afin de mieux prédire les relations entre les séquences.

Une méthode directe de production d'un MSA utilise la technique de programmation dynamique pour identifier la solution d'alignement optimale à l'échelle mondiale. Pour les protéines, cette méthode implique généralement deux ensembles de paramètres : une pénalité d'écart et une matrice de substitution attribuant des scores ou des probabilités à l'alignement de chaque paire possible d'acides aminés en fonction de la similarité des propriétés chimiques des acides aminés et de la probabilité évolutive de la mutation. Pour les séquences nucléotidiques, une pénalité d'écart similaire est utilisée, mais une matrice de substitution beaucoup plus simple, dans laquelle seules les correspondances et les mésappariements identiques sont pris en compte, est typique. Les scores de la matrice de substitution peuvent être soit tous positifs, soit un mélange de positifs et de négatifs dans le cas d'un alignement global, mais doivent être à la fois positifs et négatifs dans le cas d'un alignement local.

Pour n séquences individuelles, la méthode naïve nécessite la construction de l' équivalent n -dimensionnel de la matrice formée dans l'alignement de séquences par paires standard . L'espace de recherche augmente ainsi de manière exponentielle avec l'augmentation de n et dépend également fortement de la longueur de la séquence. Exprimé avec la grande notation O couramment utilisée pour mesurer la complexité de calcul , un MSA naïf prend un temps O(Length ^Nseqs ) à produire. Trouver l'optimum global pour n séquences de cette manière s'est avéré être un problème NP-complet . En 1989, sur la base de l'algorithme de Carrillo-Lipman, Altschul a introduit une méthode pratique qui utilise des alignements par paires pour contraindre l'espace de recherche n-dimensionnel. Dans cette approche, des alignements de programmation dynamique par paires sont effectués sur chaque paire de séquences dans l'ensemble de requêtes, et seul l'espace proche de l'intersection n-dimensionnelle de ces alignements est recherché pour l'alignement n-voies. Le programme MSA optimise la somme de toutes les paires de caractères à chaque position de l'alignement (le soi-disant score de somme de paires ) et a été implémenté dans un logiciel permettant de construire plusieurs alignements de séquences. En 2019, Hosseininasab et van Hoeve ont montré qu'en utilisant des diagrammes de décision, MSA peut être modélisé dans une complexité d'espace polynomial.

L'approche la plus largement utilisée pour les alignements de séquences multiples utilise une recherche heuristique connue sous le nom de technique progressive (également connue sous le nom de méthode hiérarchique ou arborescente) développée par Da-Fei Feng et Doolittle en 1987. L'alignement progressif construit un MSA final en combinant des alignements par paires en commençant par la paire la plus similaire et en progressant vers la plus éloignée. Toutes les méthodes d'alignement progressif nécessitent deux étapes : une première étape dans laquelle les relations entre les séquences sont représentées sous la forme d'un arbre phylogénétique , appelé arbre guide , et une deuxième étape dans laquelle le MSA est construit en ajoutant les séquences séquentiellement au MSA croissant selon l'arbre guide. L' arbre guide initial est déterminé par une méthode de clustering efficace telle que la méthode de regroupement de voisins ou la méthode de groupe de paires non pondérées avec moyenne arithmétique ( UPGMA ), et peut utiliser des distances basées sur le nombre de sous-séquences identiques de deux lettres (comme dans FASTA plutôt qu'un alignement de programmation dynamique).

Les alignements progressifs ne sont pas garantis comme étant optimaux à l'échelle mondiale. Le principal problème est que lorsque des erreurs sont commises à n'importe quelle étape de la croissance de l'AMS, ces erreurs se propagent ensuite jusqu'au résultat final. Les performances sont également particulièrement mauvaises lorsque toutes les séquences de l'ensemble sont assez éloignées. La plupart des méthodes progressives modernes modifient leur fonction de notation avec une fonction de pondération secondaire qui attribue des facteurs d'échelle aux membres individuels de l'ensemble de requêtes de manière non linéaire en fonction de leur distance phylogénétique par rapport à leurs voisins les plus proches. Cela corrige la sélection non aléatoire des séquences données au programme d'alignement.

Les méthodes d'alignement progressif sont suffisamment efficaces pour être mises en œuvre à grande échelle pour de nombreuses séquences (de quelques centaines à des milliers). Une méthode d'alignement progressif populaire est la famille Clustal . Clustal W est largement utilisé pour la construction d'arbres phylogénétiques, malgré les avertissements explicites de l'auteur selon lesquels les alignements non édités ne doivent pas être utilisés dans de telles études et comme entrée pour la prédiction de la structure des protéines par modélisation d'homologie. L'Institut européen de bioinformatique (EMBL-EBI) a annoncé que CLustalW2 expirera en août 2015. Ils recommandent Clustal Omega qui fonctionne sur la base d'arbres guides ensemencés et de techniques de profil-profil HMM pour les alignements de protéines. Un outil alternatif pour les alignements progressifs d'ADN est l'alignement multiple utilisant la transformée de Fourier rapide ( MAFFT ).

Une autre méthode d'alignement progressif courante appelée T-Coffee est plus lente que Clustal et ses dérivés, mais produit généralement des alignements plus précis pour les ensembles de séquences éloignés. T-Coffee calcule les alignements par paires en combinant l'alignement direct de la paire avec des alignements indirects qui alignent chaque séquence de la paire sur une troisième séquence. Il utilise la sortie de Clustal ainsi qu'un autre programme d'alignement local LALIGN, qui trouve plusieurs régions d'alignement local entre deux séquences. L'alignement et l'arbre phylogénétique résultants sont utilisés comme guide pour produire de nouveaux facteurs de pondération plus précis.

Les méthodes progressives étant des heuristiques dont la convergence vers un optimum global n'est pas garantie, la qualité de l'alignement peut être difficile à évaluer et leur véritable signification biologique peut être obscure. Une méthode semi-progressive qui améliore la qualité de l'alignement et n'utilise pas d'heuristique avec perte lors de l'exécution en temps polynomial a été implémentée dans le programme PSAlign.

Un ensemble de méthodes permettant de produire des MSA tout en réduisant les erreurs inhérentes aux méthodes progressives est classé comme « itératif » car il fonctionne de manière similaire aux méthodes progressives mais réaligne à plusieurs reprises les séquences initiales et ajoute de nouvelles séquences au MSA en croissance. L'une des raisons pour lesquelles les méthodes progressives dépendent si fortement d'un alignement initial de haute qualité est le fait que ces alignements sont toujours intégrés au résultat final, c'est-à-dire qu'une fois qu'une séquence a été alignée dans le MSA, son alignement n'est plus pris en compte. Cette approximation améliore l'efficacité au détriment de la précision. En revanche, les méthodes itératives peuvent revenir à des alignements par paires ou à des sous-MSA précédemment calculés incorporant des sous-ensembles de la séquence de requête comme moyen d'optimiser une fonction objective générale telle que la recherche d'un score d'alignement de haute qualité.

Une variété de méthodes d'itération subtilement différentes ont été mises en œuvre et mises à disposition dans des progiciels ; les examens et les comparaisons ont été utiles mais s'abstiennent généralement de choisir une « meilleure » technique. Le progiciel PRRN/PRRP utilise un algorithme de montée de colline pour optimiser son score d'alignement MSA et corrige de manière itérative à la fois les poids d'alignement et les régions localement divergentes ou « lacunaires » du MSA en croissance. Le PRRP fonctionne mieux lors du raffinement d'un alignement précédemment construit par une méthode plus rapide.

Un autre programme itératif, DIALIGN, adopte une approche inhabituelle en se concentrant étroitement sur les alignements locaux entre les sous-segments ou les motifs de séquence sans introduire de pénalité d'écart. L'alignement des motifs individuels est ensuite réalisé avec une représentation matricielle similaire à un tracé de matrice de points dans un alignement par paires. Une méthode alternative qui utilise des alignements locaux rapides comme points d'ancrage ou graines pour une procédure d'alignement global plus lente est implémentée dans la suite CHAOS/DIALIGN.

Une troisième méthode populaire basée sur l'itération, appelée MUSCLE (alignement de séquences multiples par attente logarithmique), améliore les méthodes progressives avec une mesure de distance plus précise pour évaluer la parenté de deux séquences. La mesure de distance est mise à jour entre les étapes d'itération (bien que, dans sa forme originale, MUSCLE ne contenait que 2 à 3 itérations selon que le raffinement était activé ou non).

Les méthodes de consensus tentent de trouver l'alignement optimal de séquences multiples à partir de plusieurs alignements différents du même ensemble de séquences. Il existe deux méthodes de consensus couramment utilisées, M-COFFEE et MergeAlign. M-COFFEE utilise des alignements de séquences multiples générés par sept méthodes différentes pour générer des alignements de consensus. MergeAlign est capable de générer des alignements de consensus à partir de n'importe quel nombre d'alignements d'entrée générés à l'aide de différents modèles d'évolution de séquence ou de différentes méthodes d'alignement de séquences multiples. L'option par défaut de MergeAlign consiste à déduire un alignement de consensus à l'aide d'alignements générés à l'aide de 91 modèles différents d'évolution de séquences protéiques.

Un modèle de Markov caché (HMM) est un modèle probabiliste qui peut attribuer des probabilités à toutes les combinaisons possibles d'écarts, de correspondances et de non-correspondances, afin de déterminer le MSA le plus probable ou l'ensemble de MSA possibles. Les HMM peuvent produire un seul résultat avec le score le plus élevé, mais peuvent également générer une famille d'alignements possibles qui peuvent ensuite être évalués pour leur signification biologique. Les HMM peuvent produire des alignements globaux et locaux. Bien que les méthodes basées sur les HMM aient été développées relativement récemment, elles offrent des améliorations significatives en termes de vitesse de calcul, en particulier pour les séquences contenant des régions qui se chevauchent.

Les méthodes typiques basées sur HMM fonctionnent en représentant un MSA comme une forme de graphe acyclique dirigé connu sous le nom de graphe d'ordre partiel, qui se compose d'une série de nœuds représentant des entrées possibles dans les colonnes d'un MSA. Dans cette représentation, une colonne qui est absolument conservée (c'est-à-dire que toutes les séquences du MSA partagent un caractère particulier à une position particulière) est codée comme un nœud unique avec autant de connexions sortantes qu'il y a de caractères possibles dans la colonne suivante de l'alignement. Dans les termes d'un modèle de Markov caché typique, les états observés sont les colonnes d'alignement individuelles et les états « cachés » représentent la séquence ancestrale présumée dont les séquences de l'ensemble de requêtes sont supposées être issues. Une variante de recherche efficace de la méthode de programmation dynamique, appelée algorithme de Viterbi , est généralement utilisée pour aligner successivement le MSA en croissance sur la séquence suivante de l'ensemble de requêtes pour produire un nouveau MSA. Ceci est différent des méthodes d'alignement progressif car l'alignement des séquences précédentes est mis à jour à chaque ajout de nouvelle séquence. Cependant, comme les méthodes progressives, cette technique peut être influencée par l'ordre dans lequel les séquences de l'ensemble de requêtes sont intégrées dans l'alignement, en particulier lorsque les séquences sont éloignées.

Plusieurs logiciels sont disponibles dans lesquels des variantes de méthodes basées sur HMM ont été implémentées et qui sont réputées pour leur évolutivité et leur efficacité, bien que l'utilisation correcte d'une méthode HMM soit plus complexe que l'utilisation de méthodes progressives plus courantes. Le plus simple est l'alignement d'ordre partiel (POA), et une méthode similaire plus générale est implémentée dans le progiciel Sequence Alignment and Modeling System (SAM). et HMMER . SAM a été utilisé comme source d'alignements pour la prédiction de la structure des protéines pour participer à l'expérience de prédiction de structure CASP (Critical Assessment of Structure Prediction) et pour développer une base de données de protéines prédites dans l' espèce de levure S. cerevisiae . HHsearch est un progiciel pour la détection de séquences protéiques à distance basées sur la comparaison par paires de HMM. Un serveur exécutant HHsearch ( HHpred ) était le plus rapide des 10 serveurs de prédiction de structure automatique dans les compétitions de prédiction de structure CASP7 et CASP8.

La plupart des méthodes d'alignement de séquences multiples tentent de minimiser le nombre d' insertions/délétions (lacunes) et, par conséquent, produisent des alignements compacts. Cela pose plusieurs problèmes si les séquences à aligner contiennent des régions non homologues , si les lacunes sont informatives dans une analyse phylogénétique . Ces problèmes sont courants dans les séquences nouvellement produites qui sont mal annotées et peuvent contenir des décalages de cadre , des domaines erronés ou des exons épissés non homologues . La première méthode de ce type a été développée en 2005 par Löytynoja et Goldman. Les mêmes auteurs ont publié un logiciel appelé PRANK en 2008. PRANK améliore les alignements lorsque des insertions sont présentes. Néanmoins, il s'exécute lentement par rapport aux méthodes progressives et/ou itératives qui ont été développées depuis plusieurs années.

En 2012, deux nouveaux outils prenant en compte la phylogénie sont apparus. L'un s'appelle PAGAN et a été développé par la même équipe que PRANK. L'autre est ProGraphMSA développé par Szalkowski. Les deux logiciels ont été développés indépendamment mais partagent des caractéristiques communes, notamment l'utilisation d' algorithmes graphiques pour améliorer la reconnaissance des régions non homologues et une amélioration du code rendant ces logiciels plus rapides que PRANK.

La recherche de motifs, également connue sous le nom d'analyse de profil, est une méthode de localisation de motifs de séquence dans des MSA globaux qui est à la fois un moyen de produire un meilleur MSA et un moyen de produire une matrice de notation à utiliser pour rechercher d'autres séquences pour des motifs similaires. Une variété de méthodes d'isolement des motifs ont été développées, mais toutes sont basées sur l'identification de motifs courts hautement conservés dans l'alignement plus large et la construction d'une matrice similaire à une matrice de substitution qui reflète la composition en acides aminés ou en nucléotides de chaque position dans le motif putatif. L'alignement peut ensuite être affiné à l'aide de ces matrices. Dans l'analyse de profil standard, la matrice comprend des entrées pour chaque caractère possible ainsi que des entrées pour les lacunes. Alternativement, les algorithmes de recherche de motifs statistiques peuvent identifier les motifs comme un précurseur d'un MSA plutôt que comme une dérivation. Dans de nombreux cas, lorsque l'ensemble de requêtes ne contient qu'un petit nombre de séquences ou ne contient que des séquences hautement apparentées, des pseudocomptes sont ajoutés pour normaliser la distribution reflétée dans la matrice de notation. En particulier, cela corrige les entrées à probabilité nulle dans la matrice en valeurs qui sont petites mais non nulles.

L'analyse par blocs est une méthode de recherche de motifs qui limite les motifs aux régions non couvertes dans l'alignement. Les blocs peuvent être générés à partir d'un MSA ou extraits de séquences non alignées à l'aide d'un ensemble précalculé de motifs communs précédemment générés à partir de familles de gènes connues. La notation par blocs repose généralement sur l'espacement des caractères à haute fréquence plutôt que sur le calcul d'une matrice de substitution explicite.

La recherche statistique de motifs a été mise en œuvre à l'aide de l' algorithme d'espérance-maximisation et de l' échantillonneur de Gibbs . L'un des outils de recherche de motifs les plus courants, appelé Multiple EM for Motif Elicitation (MEME), utilise les méthodes d'espérance-maximisation et de Markov caché pour générer des motifs qui sont ensuite utilisés comme outils de recherche par son compagnon MAST dans la suite combinée MEME/MAST.

Les régions d'ADN non codantes, en particulier les sites de liaison des facteurs de transcription (TFBS), sont conservées, mais pas nécessairement liées par l'évolution, et peuvent avoir convergé à partir d'ancêtres non communs. Ainsi, les hypothèses utilisées pour aligner les séquences protéiques et les régions codantes de l'ADN sont intrinsèquement différentes de celles qui s'appliquent aux séquences TFBS. Bien qu'il soit judicieux d'aligner les régions codantes de l'ADN pour les séquences homologues à l'aide d'opérateurs de mutation, l'alignement des séquences de sites de liaison pour le même facteur de transcription ne peut pas s'appuyer sur des opérations de mutation liées à l'évolution. De même, l'opérateur évolutif des mutations ponctuelles peut être utilisé pour définir une distance d'édition pour les séquences codantes, mais cela n'a que peu de sens pour les séquences TFBS car toute variation de séquence doit maintenir un certain niveau de spécificité pour que le site de liaison fonctionne. Cela devient particulièrement important lorsque l'on essaie d'aligner des séquences TFBS connues pour construire des modèles supervisés permettant de prédire des emplacements inconnus du même TFBS. Par conséquent, les méthodes d'alignement de séquences multiples doivent ajuster l'hypothèse évolutive sous-jacente et les opérateurs utilisés comme dans le travail publié incorporant des informations thermodynamiques de base voisines pour aligner les sites de liaison à la recherche de l'alignement thermodynamique le plus bas conservant la spécificité du site de liaison.

Les techniques d'optimisation standard en informatique, toutes deux inspirées par des processus physiques, mais ne les reproduisant pas directement, ont également été utilisées pour tenter de produire plus efficacement des MSA de qualité. L'une de ces techniques, les algorithmes génétiques , a été utilisée pour la production de MSA dans le but de simuler largement le processus évolutif hypothétique qui a donné lieu à la divergence dans l'ensemble de requêtes. La méthode consiste à décomposer une série de MSA possibles en fragments et à réorganiser ces fragments de manière répétée en introduisant des espaces à des positions variables. Une fonction objective générale est optimisée pendant la simulation, le plus souvent la fonction de maximisation de la « somme des paires » introduite dans les méthodes MSA basées sur la programmation dynamique. Une technique pour les séquences protéiques a été implémentée dans le logiciel SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) et son équivalent dans l'ARN est appelé RAGA.

La technique de recuit simulé , par laquelle un MSA existant produit par une autre méthode est affiné par une série de réarrangements conçus pour trouver de meilleures régions d'espace d'alignement que celle que l'alignement d'entrée occupe déjà. Comme la méthode de l'algorithme génétique, le recuit simulé maximise une fonction objective comme la fonction somme de paires. Le recuit simulé utilise un « facteur de température » métaphorique qui détermine la vitesse à laquelle les réarrangements se déroulent et la probabilité de chaque réarrangement ; l'utilisation typique alterne des périodes de taux de réarrangement élevés avec une probabilité relativement faible (pour explorer des régions plus éloignées de l'espace d'alignement) avec des périodes de taux plus faibles et de probabilités plus élevées pour explorer plus en profondeur les minima locaux à proximité des régions nouvellement « colonisées ». Cette approche a été mise en œuvre dans le programme MSASA (Multiple Sequence Alignment by Simulated Annealing).

La programmation mathématique et en particulier les modèles de programmation mixte en nombres entiers sont une autre approche pour résoudre les problèmes MSA. L'avantage de ces modèles d'optimisation est qu'ils peuvent être utilisés pour trouver la solution MSA optimale plus efficacement que l'approche DP traditionnelle. Cela est dû en partie à l'applicabilité des techniques de décomposition pour les programmes mathématiques, où le modèle MSA est décomposé en parties plus petites et résolu de manière itérative jusqu'à ce que la solution optimale soit trouvée. Les exemples d'algorithmes utilisés pour résoudre les modèles de programmation mixte en nombres entiers de MSA incluent la décomposition de branche et de prix et de Benders . Bien que les approches exactes soient lentes en termes de calcul par rapport aux algorithmes heuristiques pour MSA, elles garantissent d'atteindre la solution optimale à terme, même pour les problèmes de grande taille.

En janvier 2017, D-Wave Systems a annoncé que son logiciel de calcul quantique open source qbsolv avait été utilisé avec succès pour trouver une solution plus rapide au problème MSA.

L'utilisation nécessaire d'heuristiques pour l'alignement multiple signifie que pour un ensemble arbitraire de protéines, il y a toujours une bonne chance qu'un alignement contienne des erreurs. Par exemple, une évaluation de plusieurs programmes d'alignement de premier plan utilisant le benchmark BAliBase a révélé qu'au moins 24 % de toutes les paires d'acides aminés alignés étaient mal alignées. Ces erreurs peuvent survenir en raison d'insertions uniques dans une ou plusieurs régions de séquences, ou d'un processus évolutif plus complexe conduisant à des protéines qui ne s'alignent pas facilement par séquence seule. À mesure que le nombre de séquences et leur divergence augmentent, de nombreuses autres erreurs seront commises simplement en raison de la nature heuristique des algorithmes MSA. Les visualiseurs d'alignement de séquences multiples permettent de réviser visuellement les alignements, souvent en inspectant la qualité de l'alignement pour les sites fonctionnels annotés sur deux séquences ou plus. Beaucoup permettent également de modifier l'alignement pour corriger ces erreurs (généralement mineures), afin d'obtenir un alignement « organisé » optimal adapté à une utilisation dans l'analyse phylogénétique ou la modélisation comparative.

Cependant, à mesure que le nombre de séquences augmente, et en particulier dans les études à l'échelle du génome qui impliquent de nombreuses MSA, il est impossible de sélectionner manuellement tous les alignements. De plus, la sélection manuelle est subjective. Et enfin, même le meilleur expert ne peut pas aligner avec confiance les cas les plus ambigus de séquences très divergentes. Dans de tels cas, il est courant d'utiliser des procédures automatiques pour exclure les régions non alignées de la MSA. Dans le cadre de la reconstruction phylogénétique (voir ci-dessous), le programme Gblocks est largement utilisé pour supprimer les blocs d'alignement suspects de faible qualité, en fonction de divers seuils sur le nombre de séquences manquantes dans les colonnes d'alignement. Cependant, ces critères peuvent filtrer de manière excessive les régions avec des événements d'insertion/délétion qui peuvent encore être alignées de manière fiable, et ces régions peuvent être souhaitables à d'autres fins telles que la détection d'une sélection positive. Quelques algorithmes d'alignement génèrent des scores spécifiques au site qui permettent la sélection de régions à haute confiance. Un tel service a été proposé pour la première fois par le programme SOAP, qui teste la robustesse de chaque colonne aux perturbations dans les paramètres du programme d'alignement populaire CLUSTALW. Le programme T-Coffee utilise une bibliothèque d'alignements dans la construction du MSA final, et son MSA de sortie est coloré en fonction des scores de confiance qui reflètent l'accord entre les différents alignements de la bibliothèque concernant chaque résidu aligné. Son extension, Transitive Consistency Score (TCS), utilise les bibliothèques T-Coffee d'alignements par paires pour évaluer tout MSA tiers. Les projections par paires peuvent être produites à l'aide de méthodes rapides ou lentes, permettant ainsi un compromis entre vitesse et précision. Un autre programme d'alignement qui peut générer un MSA avec des scores de confiance est FSA, qui utilise un modèle statistique qui permet de calculer l'incertitude dans l'alignement. Le score HoT (Heads-Or-Tails) peut être utilisé comme mesure de l'incertitude d'alignement spécifique au site en raison de l'existence de plusieurs solutions co-optimales. Le programme GUIDANCE calcule une mesure de confiance similaire spécifique au site, basée sur la robustesse de l'alignement par rapport à l'incertitude dans l'arbre guide utilisé dans les programmes d'alignement progressif. Une approche alternative, plus justifiée statistiquement, pour évaluer l'incertitude de l'alignement est l'utilisation de modèles évolutionnaires probabilistes pour l'estimation conjointe de la phylogénie et de l'alignement. Une approche bayésienne permet de calculer les probabilités postérieures de la phylogénie et de l'alignement estimés, ce qui est une mesure de la confiance dans ces estimations. Dans ce cas, une probabilité postérieure peut être calculée pour chaque site de l'alignement. Une telle approche a été mise en œuvre dans le programme BAli-Phy.

Il existe des programmes gratuits disponibles pour la visualisation de plusieurs alignements de séquences, par exemple Jalview et UGENE .

Plusieurs alignements de séquences peuvent être utilisés pour créer un arbre phylogénétique . Ceci est rendu possible pour deux raisons. La première est que les domaines fonctionnels connus dans les séquences annotées peuvent être utilisés pour l'alignement dans les séquences non annotées. L'autre est que des régions conservées connues pour être fonctionnellement importantes peuvent être trouvées. Cela permet d'utiliser plusieurs alignements de séquences pour analyser et trouver des relations évolutives par l'homologie entre les séquences. Les mutations ponctuelles et les événements d'insertion ou de suppression (appelés indels) peuvent être détectés.

Les alignements de séquences multiples peuvent également être utilisés pour identifier des sites fonctionnellement importants, tels que des sites de liaison, des sites actifs ou des sites correspondant à d'autres fonctions clés, en localisant des domaines conservés. Lors de l'examen de plusieurs alignements de séquences, il est utile de prendre en compte différents aspects des séquences lors de la comparaison des séquences. Ces aspects comprennent l'identité, la similarité et l'homologie. L'identité signifie que les séquences ont des résidus identiques à leurs positions respectives. D'autre part, la similarité est liée au fait que les séquences comparées ont des résidus quantitativement similaires. Par exemple, en termes de séquences nucléotidiques, les pyrimidines sont considérées comme similaires les unes aux autres, tout comme les purines. La similarité conduit finalement à l'homologie, dans la mesure où plus les séquences sont similaires, plus elles sont proches d'être homologues. Cette similarité dans les séquences peut ensuite aider à trouver une ascendance commune.